El diagnóstico de tumores, así como el de algunas enfermedades degenerativas o inflamatorias, se basa en muchos casos en la detección (en general por parte de patólogos) de ciertos marcadores específicos o antígenos presentes en muestras de tejidos obtenidos de pacientes. Científicos de la Universidad Nacional de La Plata proponen un método alternativo y más económico para el diagnóstico histopatológico utilizando diferentes tipos de nanopartículas (NPs) plasmónicas de metales nobles, como el oro y la plata.
En la actualidad la detección de tumores se realiza en gran medida a través de técnicas de inmunohistoquímica empleando anticuerpos (Ac) monoclonales llamados primarios, los que se unen específicamente a los marcadores. Por otra parte, ciertas biomoléculas de reconocimiento (otros Ac llamados secundarios, proteínas A ó G, lectinas, etc.) se unen a moléculas coloreadas o fluorescentes formando conjugados. Éstos se unen a su vez a los Ac primarios, lo que permite la detección de los marcadores buscados.
Sin embargo, esta estrategia tiene varios inconvenientes, ya que al costo de las biomoléculas de reconocimiento se suma el de los delicados reactivos empleados para la detección, en general en forma de kits comerciales. En particular, las enzimas utilizadas comúnmente se pueden desnaturalizar, mientras que los fluoróforos pueden sufrir el fenómeno de blanqueamiento debido a la irradiación prolongada, lo que dificulta el proceso de detección. Cabe señalar asimismo que el uso de fluoróforos requiere microscopios más complejos, lo que implica mayores costos y personal con mayor capacitación.
Nuevo método para detectar tumores
El desarrollo de los investigadores de la UNLP forma parte del trabajo de tesis de doctorado de la Lic. Guillermina Boggan Simal, dirigida por las Dras. Carolina Vericat y María Ana Huergo en el Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas (INIFTA) dependiente de la Facultad de Ciencias Exactas y del CONICET. La investigación propone un método alternativo para el diagnóstico histopatológico utilizando diferentes tipos de NPs plasmónicas de oro y plata conjugadas con Ac, los cuales se pueden unir a su vez a los marcadores buscados.
Debido a su naturaleza plasmónica, ciertas nanopartículas de estos metales, de tamaño y forma adecuados, presentan la propiedad de dispersar la luz de manera muy eficiente en la región visible o infrarroja cercana. Este fenómeno físico permite su observación mediante microscopía óptica de campo oscuro (MCO), la cual requiere solo un microscopio óptico sencillo, como los que se usan en los laboratorios convencionales de patología, al que se le coloca un condensador de campo oscuro.
Dependiendo del metal y la morfología es posible obtener nanopartículas que dispersen luz de diferentes colores, lo que permitiría el desarrollo de ensayos multiplex para detectar varios marcadores en forma simultánea (cada uno de ellos reconocido por un Ac diferente).
Ventajas
Otra ventaja de esta propuesta es que las nanopartículas no sufren blanqueamiento como consecuencia de la irradiación. Por último, el desarrollo puede ser realizado enteramente en nuestro país, desde la síntesis de las nanopartículas, pasando por la preparación de las muestras, hasta la observación por microscopía, sin necesidad de usar kits comerciales importados y costosos.
La Dra. Carolina Vericat explicó: “en una primera etapa del proyecto sintetizamos NPs esféricas de oro de aproximadamente 80 nm por un método de crecimiento de semillas (en el que se crecen NPs grandes en varias etapas, empleando como semillas las NPs sintetizadas en la etapa anterior). Estas NPs, que inicialmente están recubiertas por citratos, se recubren con ciertos compuestos que tienen azufre (tioles) que tienen más afinidad por la superficie del metal, desplazando a los citratos”.
“Mediante la unión química de Ac secundarios a los tioles de las NP hemos obtenido conjugados NP-Ac secundarios estables. En el caso de las NPs de oro de 80 nm se observa por MCO que la luz dispersada es de color amarillo. Si se usan NPs esféricas de plata de tamaños similares, la luz dispersada es violeta y si se emplean NPs triangulares o nanoestrellas, la luz es roja”.
Por otra parte, en colaboración con el Dr. Martín Enrique Rabassa del Centro de Investigaciones Inmunológicas Básicas y Aplicadas CINIBA (Facultad de Ciencias Médicas, UNLP-CIC), se tratan las muestras de tejidos tumorales de pacientes con otros Ac monoclonales (primarios), los cuales se unen a los marcadores o antígenos característicos de los tumores. En particular empleamos algunas muestras de tejidos cancerosos de mama y de cabeza-cuello provenientes del CINIBA. A continuación, a las muestras de tejido tratadas con los Ac primarios se les agregan los conjugados NP-Ac secundario.
Marcadores tumorales
En caso de estar presentes los marcadores tumorales, los Ac primarios quedarán unidos a éstos, y los Ac secundarios se unirán a su vez a los Ac primarios. Dado que los Ac secundarios tienen unida una NP de oro, se observará por MCO un punto brillante de un color característico (en este caso, amarillo) debido a la dispersión de la luz en la región en la que se encuentre el marcador buscado (resultado positivo). Por el contrario, de no haber marcadores tumorales no habrá inmuno-reconocimiento, ya que los Ac primarios no se unirán a éstos y por tanto los conjugados NP-Ac secundario no quedarán retenidos, con lo cual no se verán regiones de color amarillo brillante (resultado negativo). Algo similar ocurriría con las NPs de otros colores, lo que permitirá la detección simultánea de distintos marcadores.
Financiamiento de la provincia de Buenos Aires a proyectos de innovación, a través del FITBA
Estas investigaciones forman parte del proyecto “Desarrollo de un método de diagnóstico patológico multiplex basado en el uso de nanopartículas plasmónicas”, recientemente financiado en la convocatoria FITBA 2024 en la categoría “Desarrollo de un nuevo proceso productivo”, cuya investigadora responsable es la Dra. Huergo del INIFTA, siendo BIOGENAR La Plata la empresa adoptante.
Participantes del grupo “Nanomateriales de Interés en Biomedicina” (NanoBioMed) del INIFTA: Lic. Guillermina Boggan Simal, Dra. María Ana Huergo y Dra. Carolina Vericat.Colaboradores de otras instituciones: Dr. Martín Enrique Rabassa (CINIBA); Dra. Elaine De Freitas y Téc. Catalina Crespo (Laboratorio de Patología y Citología, SA – BIOGENAR La Plata).
